penentuan kadar glukosa darah

I.                   JUDUL PERCOBAAN                   : Penentuan Kadar Glukosa Darah

II.                HARI/TANGGAL PERCOBAAN : Rabu, 26 September 2018, pukul 13.00-16.00

III.             TUJUAN PERCOBAAN                : Menentukan kadar glukosa dalam darah

IV.             DASAR TEORI                                :

Glukosa

Glukosa, suatu gula monosakarida adalah salah satu karbohidrat terpenting yang digunakan sebagai sumber tenaga bagi hewan dan tumbuhan. Glukosa merupakan salah satu hasil utama fotosintesis dan awal bagi respirasi. Bentuk alami (D-glukosa) disebut juga dekstrosa, terutama pada industri pangan. Glukosa adalah suatu aldoheksosa dan sering disebut dekstrosa karena mempunyai sifat dapat memutar cahaya terpolarisasi kearah kanan.

Glukosa adalah sumber energi utama bagi tubuh. Hormon yang mempengaruhi kadar glukosa adalah insulin dan glukagon yang berasal dari pankreas. Insulin dibutuhkan untuk permeabilitas membran sel terhadap glukosa dan untuk transportasi glukosa ke dalam sel (Joyce, 2013). Glukosa merupakan salah satu karbohidrat yang sangat penting dan dibutuhkan sebagai sumber energi dan merupakan bahan bakar utama bagi otak dan sel darah merah. Glukosa dapat diperoleh dari makanan yang mengandung karbohidrat (Marks, 1996).

Glukosa Darah

Kadar glukosa darah adalah istilah yang mengacu kepada tingkat glukosa di dalam darah. Konsentrasi gula darah, atau tingkat glukosa serum, diatur dengan ketat di dalam tubuh. Umumnya tingkat gula darah bertahan pada batas-batas yang sempit sepanjang hari (70-150 mg/dl). Tingkat ini meningkat setelah makan dan biasanya berada pada level terendah pada pagi hari, sebelum orang makan (Henrikson J. E. et al., 2009).          

Kadar glukosa darah sepanjang hari bervariasi dimana akan meningkat setelah makan dan kembali normal dalam waktu 2 jam. Kadar glukosa darah yang normal pada pagi hari setelah malam sebelumnya berpuasa adalah 70-110 mg/dL darah. Kadar glukosa darah biasanya kurang dari 120-140 mg/dL pada 2 jam setelah makan atau minum cairan yang mengandung glukosa maupun karbohidrat lainnya (Price, 2005).

Semua sel dengan tiada hentinya mendapat glukosa ; tubuh mempertahankan kadar glukosa dalam darah yang konstan, yaitu sekitar 80- 100 mg/dl bagi dewasa dan 80-90 mg/dl bagi anak, walaupun pasokan makanan dan kebutuhan jaringan berubah-ubah sewaktu kita tidur, makan, dan bekerja (Cranmer H. et al., 2009)

Proses ini disebut homeostasis glukosa. Kadar glukosa yang rendah, yaitu hipoglikemia dicegah dengan pelepasan glukosa dari simpanan glikogen hati yang besar melalui jalur glikogenolisis dan sintesis glukosa dari laktat, gliserol, dan asam amino di hati melalui jalur glukonoegenesis dan melalui pelepasan asam lemak dari simpanan jaringan adiposa apabila pasokan glukosa tidak mencukupi. Kadar glukosa darah yang tinggi yaitu hiperglikemia dicegah oleh perubahan glukosa menjadi glikogen dan perubahan glukosa menjadi triasilgliserol di jaringan adiposa. Keseimbangan antarjaringan dalam menggunakan dan menyimpan glukosa selama puasa dan makan terutama dilakukan melalui kerja hormon homeostasis metabolik yaitu insulin dan glukagon ( Ferry R. J., 2008).

Sel darah merah hanya dapat menggunakan glukosa sebagai bahan bakar. Ini kerana sel darah merah tidak memiliki mitokondria, tempat berlangsungnya sebagian besar reaksi oksidasi bahan seperti asam lemak dan bahan bakar lain. Sel darah merah memperoleh energi melalui proses glikolisis yaitu pengubahan glukosa menjadi piruvat. Piruvat akan dibebaskan ke dalam darah secara langsung atau diubah menjadi laktat kemudian dilepaskan. Sel darah merah tidak dapat bertahan hidup tanpa glukosa. Tanpa sel darah merah, sebagian besar jaringan tubuh akan menderita kekurangan energi karena jaringan memerlukan oksigen agar dapat sempurna mengubah bahan bakar menjadi CO2 dan H2O (Aswani V., 2010).

Pada tubuh manusia glukosa yang telah diserap oleh usus halus kemudian akan terdistribusi ke dalam semua sel tubuh melalui aliran darah. Di dalam tubuh, glukosa tidak hanya dapat tersimpan dalam bentuk glikogen di dalam otot & hati namun juga dapat tersimpan pada plasma darah dalam bentuk glukosa darah (blood glucose). Di dalam tubuh selain akan berperan sebagai bahan bakar bagi proses  metabolisme, glukosa juga akan berperan sebagai sumber energi utama bagi kerja otak. Melalui proses oksidasi yang terjadi di dalam sel-sel tubuh, glukosa kemudian akan digunakan untuk mensintesis molekul ATP (adenosine triphosphate) yang merupakan molukel molekul dasar penghasil energi di dalam tubuh. Dalam konsumsi keseharian, glukosa akan menyediakan hampir 50—75% dari total  kebutuhan energi tubuh (Irawan, 2007).

Kekurangan dan Kelebihan Glukosa

Bila kadar gula dalam darah melebihi atau kurang dari batas normal maka sistem metabolisme dalam tubuh akan terganggu. Darah manusia normal mengandung glukosa dalam jumlah atau konsentrasi tetap, yaitu antara 70-100 mg tiap 100 ml darah (Poedjiadi, 1994). Metabolisme glukosa yang tidak normal dapat menyebabkan hiperglikemia (bila kadar gula darah berada pada kadar tinggi ( > 110 mg/dl )) dan hipoglikemia ( bila kadar glukosa darah terlalu rendah ( < 70 mg/dl ).

1.      Hiperglikemia

Hiperglikemia adalah suatu kondisi di mana jumlah glukosa yang beredar dalam plasma darah terlalu berlebihan, yaitu sampai diatas 110 mg/dL. Salah satu contoh penyakit yang disebabkan oleh kadar glukosa yang terlalu tinggi  yaitu diabetes mellitus.  Diabetes mellitus atau yang lebih dikenal dengan kencing manis merupakan penyakit yang timbul karena suatu gangguan dari pankreas, yaitu organ tubuh yang biasa menghasilkan insulin dan sangat berperan dalam metabolisme glukosa bagi sel tubuh (Achjadi 2003).

2.      Hipoglikemia

Hipoglikemia adalah suatu keadaan dimana kadar gula darah hingga dibawah 60 mg/dl.  Dalam keadaan normal, tubuh mempertahankan kadar gula darah antara 70-110 mg/dL. Sementara pada penderita diabetes, kadar gula darahnya tersebut berada pada tingkat terlalu tinggi, sedangkan pada penderita hipoglikemia, kadar gula darahnya berada pada tingkat terlalu rendah. Kadar gula darah yang rendah menyebabkan berbagai sistem organ tubuh mengalami kelainan fungsi. Otak sebagai organ yang sangat peka terhadap kadar gula darah yang rendah, akan memberikan respon melalui sistem saraf, merangsang kelenjar adrenal untuk melepaskan epinefrin (adrenalin). Hal ini selanjutnya akan merangsang hati untuk melepaskan gula agar kadarnya dalam darah tetap terjaga.

Metode Pengukuran  Kadar Glukosa

1.      Metode kimia

Prinsip pemeriksaan ini, yaitu proses kondensasi glukosa dengan akromatik amin dan asam glasial pada suasana panas, sehingga terbentuk senyawa berwarna hijau kemudian diukur dengan fotometri. Beberapa kelemahan atau kekurangan dari metode kimia adalah memerlukan langkah pemeriksaan yang panjang dengan pemanasan, sehingga memungkinkan terjadinya kesalahan besar bila dibandingkan dengan metode enzimatik. Selain itu, reagen-reagen pada metode kimiawi ini bersifat korosif pada alat laboratorium.

2.      Metode enzimatik.

Metode enzimatik pada pemeriksaan glukosa darah memberikan hasil dengan spesifitas yang tinggi, karena hanya glukosa yang akan terukur. Cara ini adalah cara yang digunakan untuk menentukan nilai batas. Ada 2 macam metode enzimatik yang digunakan yaitu glucose oxidase dan metode hexokinase.

3.      Metode glukosa oksidase.

Prinsip pemeriksaan ini adalah enzim glukosa oksidasi mengkatalisis reaksi oksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan hidrogen peroksida yang terbentuk bereaksi dengan phenol dan 4 – amino phenazone dengan bantuan enzim peroksidase menghasilkan quinoneimine yang berwarna merah muda dan dapat diukur dengan fotometer pada λ = 546 nm. Intensitas warna yang terbentuk setara dengan kadar glukosa darah yang terdapat dalam sampel. Digunakannya enzim glucose oxidase pada reaksi pertama menyebabkan sifat reaksi pertama spesifik untuk glukosa.

4.      Metode hexokinase

Prinsip pemeriksaan pada metode ini adalah hexokinase akan mengkatalis reaksi fosforilasi glukosa dengan ATP membentuk glukosa-6-fosfat dan ADP. Enzim kedua yaitu glukosa-6-fosfat dehidrogenase akan mengkatalisis oksidasi glukosa-6-fosfat dengan nicotinamide adenine dinocleotide phosphate (NADP+). Pada metode ini digunakan dua macam enzim yang baik karena kedua enzim ini spesifik. Akan tetapi, metode ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.

Pada percobaan ini Glukosa darah ditentukan dengan prinsip penentuannya yang didasari pada kemampuan glukosa untuk mereduksi ion anorganik seperti Cu²⁺. Glukosa darah akan mereduksi ion Cu²⁺ di dalam larutan kupritartrat oleh glukosa darah menjadi ion kupro (Cu⁺). Sebelumnya  darah harus bebas protein  (deproteinasi filtrat darah). Deproteinasi dilakukan karena dalammenentukan kadar glukosa darah maka albumin/protein dalam darah harusdihilangkan karena protein juga dapat bereaksi dengan Cu, ketika protein telahterdenaturasi maka tidak akan mengganggu absorbansi glukosa dengan analisis absorbansinya.

Glukosa darah akan mereduksi Cu²⁺ dalam suasana basa, yang hasil reduksinya akan bereaksi dengan arsenomolibdat menghasilkan warna biru. glukosa dapat mereduksi Cu²⁺ karena glukosa merupakan gula pereduksi yang dapat mereduksi senyawa-senyawa penerima electron. Pada penambahan Ba(OH)₂ sampel darah sedikit menggumpal. Ba(OH)₂ ini berfungsi memberikan suasana basa dan juga mengendapkan ion-ion besi dalam darah. Salah satu ion besi yang diendapkan adalah ion besi pada haemoglobin , ion besi ini diubah menjadi molekul Fe(OH)₂ berupa endapan merah.

 Pada ZnSO₄ maka endapan merah dari sampel semakin banyak dan terakoagulasi menjadi pucat. Penambahan ZnSO₄ ini berfungsi untuk mengendapkan dan juga mendenaturasi protein secara sempurna. Karena berat jenis yang lebih besar dari berat jenis glukosa yang akan dianalisis, maka pemisahan selanjutnya dilakukan dengan sentrifuge untuk mengendapkan protein. Pengendapan ini bertujuan untuk memisahkan protein dari glukosa karena akan mengganggu pengukuran. Penentuan kadar selanjutnya akan dilakukan dengan cara spektrofotometri. Untuk mengukur arbsorbansinya maka ditambahkan Cu alkalis dan juga arsenomolibdat. Penambahan Cu alkalis dalam suasana basa akan mereduksi senyawa Cu²⁺ menjadi Cu yang bereaksi dengan arsenomolbdat menghailkan warna biru.

Senyawa Cu₂O yang terbentuk dari hasil penambahan larutan kupritartrat bereaksi dengan asam fosfomolibdat membentuk senyawa fosfomolibdenumoksida yang berwarna biru tua. Intensitas warna biru yang terbentuk sebandingdengan kadar glukosa didalam darah sampel sehingga dapat diukur serapannya  secara spektrofotometri. Filtrat bebas protein dipanaskan dalam larutan tembaga alkalis akan menghasilkan Cu₂O. Kemudian Cu₂O direaksikan dengan asam fosfomolibdat yang akan menghasilkan warna biru yang dapat dibaca pada  spektrofotometer  pada panjang gelombang 660 nm. Intensitas warna biru molibdat ini merupakan ukuran banyaknya tembaga yang direduksi dengan demikian menyatakan jumlah glukosa yang diperoleh dibandingkandengan standar. Metode ini memiliki beberapa keuntungan, antara lain hanya dibutuhkan dua pelarut, filtrat yang terbentuk lebih netral, dan proses filtrasi ebih cepat. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut.

Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Rohman, 2007). Dibawah ini adalah perumpamaan jalannya proses pada Spektrofotometer UV-VIS.

Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan Hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik melewati suatu media, maka sebagian cahaya tersebut diserap, sebagian dipantulkan, dan sebagian di pancarkan. Perubahan warna yang terjadi diamati dan intensitas warnanya diamati dengan  spektronik 20 pada panjang gelombang maksimum yaitu 660 nm.

Persamaannya yaitu:

A= a  x  b  x c

Dimana:

A   : absorbansi (serapan cahaya)

a    : absortivitas

b    : tebal kuvet

c    : konsentrasi sampel

          VI.            ALAT DAN BAHAN

1.      Alat

a.       Spektronik 20                     1 set

b.      Sentrifuge                           1 set

c.       Tabung reaksi                      10 buah

d.      Penangas air                        1 buah

e.       Gelas ukur                           2 buah

f.       Gelas piala                          1 buah

g.      Pipet tetes                           10 buah

h.      Pengaduk                            1 buah

i.        Penjepit kayu                      1 buah

2.      Bahan

a.       Darah

b.      Larutan standar glukosa 2 mg/L

c.       Larutan Cu alkalis

d.      Larutan Ba(OH)₂ 0,3 N

e.       Larutan ZnSO_4­.7H₂O 5%

f.       Pereaksi arsenomolibdat

g.      Aquades

                      VII.            PROSEDUR PERCOBAAN

a.       Deproteinasi filtrate darah

 

b.      Penentuan kadar darah

 

c.       Pembuatan kurva standart

d.      Larutan blanko

 

                   VIII.   HASIL PENGAMATAN

No.	Prosedur Percobaan	Hasil Pengamatan		Dugaan/Reaksi	Kesimpulan
1.	Deproteinasi filtrat darah	Sebelum	Sesudah	·      kadar glukosa dalam darah normalnya pada orang puasa berkisar 100-125 mg/dL. Sedangkan glukosa darah 2 jam setelah makan glukosanberkisar 140-199 mg/dL (Konsensus, 2011)	Protein dalam darah terpisah dan diperoleh filtrat berwarna kekukningan yang bebas protein
		-       sampel darah: berwarna merah darah -       Na-sitrat ; larutan tak berwarna -       Ba(OH)2 : larutan tidak berwarna -       Aquades : tidak berwarna -       (NH4)2SO4 : larutan tidak berwarna -       Biuret : larutan berwarna biru -       ZnSO4.7H2O : larutan tidak berwarna	-    Sampel darah + aquades + Na sitrat: larutan berwarna merah sedikit encer -    Sampel darah + aquades + Ba(OH)2 : larutan berwarna merah bata -    Sampel darah + aquades + Ba(OH)2 + ZnSO4.7H2O : larutan agak mengental (merah bata) -    Sampel darah + aquades + Ba(OH)2 + ZnSO4.7H2O + (NH4)2SO4 : larutan berwarna merah sedikit encer -    Disentrifuge : terbentuk 2 lapisan -     Filtrat : larutan agak kekuningan -    Residu : endapan merah -    Filtrat + biuret : larutan sedikit berwarna keunguan
2.	Penentuan kadar glukosa darah	-    Filtrat darah : agak kekuningan -    Cu alkalis : larutan berwarna biru (+++) -    Arsenomolibdat : larutan berwarna kekuningan	-    Filtrat + Cu alkalis : larutan biru (+) -    Dimasukkan air mendidih : terbentuk endapan putih -    Dimasukkan air dingin : larutan berwarna biru, ada endapan putih -    Ditambah 2 tetes arsenomo-libdat : endapan sedikit larut, larutan berwarna biru -    Absorbansi : 1,123	§ § Cu2O (s) + arsenomolibdat (aq) ⟶ molybdenum (aq)	Kadar glukosa pada sampel adalah 1,078 mg/mL atau 107,8 mg/100 mL, absorbansi yang diperoleh sebesar 1,123
3.	Pembuatan kurva standar	-                     Larutan glukosa pada : ·                    (0,1;0,3;0,5;0,7;0,9) mg/mL : larutan tidak berwarna Pereaksi arsenomo-libdat : larutan berwarna kekuningan	Larutan glukosa + Cu alkalis : -       (0,1;0,3;0,5;0,7;0,9)  mg/mL : larutan berwarna biru Dimasukkan air mendidih : -       0,1 mg/mL: larutan berwarna biru -       0,3 mg/mL : larutan berwarna biru kemerahan -       0,5 mg/L : larutan berwarna biru kemerahan (+) -       0,7 mg/L : larutan berwarna biru kemerahan (++) -       0,9 mg/L : larutan berwarna biru kemerahan(+++) Dimasukkan air dingin 10 menit: -       0,1 mg/mL: larutan berwarna biru -       0,3 mg/mL : larutan berwarna biru kemerahan -       0,5 mg/L : larutan berwarna biru kemerahan (+) -       0,7 mg/L : larutan berwarna biru kemerahan (++) -       0,9 mg/L : larutan berwarna biru kemerahan(+++) -+ 2 tetes arsenomolibdat: -       0,1 mg/mL: larutan berwarna biru -       0,3 mg/mL : larutan berwarna biru kemerahan -       0,5 mg/L : larutan berwarna biru kemerahan (+) -       0,7 mg/L : larutan berwarna biru kemerahan (++) -       0,9 mg/L : larutan berwarna biru kemerahan(+++) Absorbansi : -          Standar 1 : 0.512 -          Standar 2 : 0.777 -          Standar 3 : 0.767 -          Standar 4 : 0.997 -          Standart 5 ; 0.956	Semakin besar konsentrasi, semakin tinggi nilai absorbansinya	Absorbansi yang diperoleh pada larutan standar : Glukosa 0,1 mg/mL  : 0.512 Glukosa 0,3 mg/mL  : 0.777 Glukosa 0,5 mg/mL  : 0.767 Glukosa 0,7 mg/mL  : 0.997 Glukosa 0,9 mg/mL  ; 0.956 R² = 0.8312 Persamaan yang diperoleh adalah y = 0.554x + 0.5248
4.	Larutan blanko	-       Aquades : tidak berwarna -       Cu alkalis : larutan berwarna biru (+++) -       Pereaksi arseno-molibdat : larutan berwarna kekuningan	-          Aquades + Cu alkalis : larutan warna biru (++) -          Dimasukkan dalam air mendidih : larutan berwarna biru -          Dimasukkan dalam air dingin : larutan berwarna biru -          + pereaksi arseno-molibdat : larutan berwarna biru		Larutan blanko dijadikan sebagai larutan pembanding yang hasil absirbansinya akan digunakan sebagai auto zero dari instrument.

          IX.            ANALISIS DAN PEMBAHASAN

Percobaan dengan judul Penentuan Kadar Glukosa dalam Darah ini dilaksanakan pada tanggal 26 September 2018 di laboratorium Biokimia Universitas Negeri Surabaya. Percobaan ini bertujuan untuk mengatahui kadar glukosa dalam darah dengan menggunakan bantuan Instrumen Spektrofotometri UV-Vis.  Glukosa, suatu gula monosakarida adalah salah satu karbohidrat terpenting yang digunakan sebagai sumber tenaga bagi hewan dan tumbuhan. Glukosa merupakan salah satu karbohidrat yang sangat penting dan dibutuhkan sebagai sumber energi dan merupakan bahan bakar utama bagi otak dan sel darah merah. Glukosa dapat diperoleh dari makanan yang mengandung karbohidrat (Marks, 1996).

Kadar glukosa darah adalah istilah yang mengacu kepada tingkat glukosa di dalam darah. Umumnya tingkat gula darah bertahan pada batas-batas yang sempit sepanjang hari .

Kadar glukosa darah yang normal pada pagi hari setelah malam sebelumnya berpuasa adalah 70-110 mg/dL darah. Kadar glukosa darah biasanya kurang dari 120-140 mg/dL pada 2 jam setelah makan atau minum cairan yang mengandung glukosa maupun karbohidrat lainnya (Price, 2005).

Pada percobaan ini, dialakukan beberapa tahap. Tahap tersebut ialah deproteinasi filtrat darah, penentuan kadar glukosa darah, pembuatan kurva standar, dan pembuatan larutan blanko. Selain itu, percobaan ini diawali dengan mempersiapkan dan membersihkan peralatan yang akan digunakan seperti tabung reaksi, pipet tetes, gelas ukur, gelas kimia, pengaduk, penangas air, penjepit kayu, kuvet, spektrofotometer UV-Vis dan sentrifuge. Pembersihan dilakukan untuk menghilangkan pengotor atau zat pengganggu yang dapat mengkontaminasi dan mempengaruhi keakuratan hasil akhir. Di samping itu, mempersiapkan pula bahan-bahan yang akan digunakan yakni larutan Cu alkalis, larutan Ba(OH) 0,3 N, larutan ZnSO₄.7H­₂O 5%, pereaksi arsenomolibdat, larutan standar glukosa 1%, dan aquades.

Berikut adalah pembahasan pada tiap tahap yang dilakukan.

1.    Deproteinase Filtat Darah

Dipersiapkan 1 mL darah oxalated (encer ) dari salah seorang praktikkan yang telah sarapan dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge yang didalamnya telah berisi 3 aquadest serta 3 tetes Na-sitrat. Penambahan aquades ini bertujuan untuk pengenceran dan agar albumin dalam darah bisa larut. Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi oleh panas dan biasanya terdapat dalam serum darah. Na-sitrat berfungsi sebagai anti koagulan agar darah yang dipersiapkan tidak membeku. Tabung centrifuge digoyang-goyangkan agar campuran aquadest, Na-sitrat dengan darah dapat bercampur homogeny.

Kemudian ditambahkan 1 ml Ba(OH)₂ 0,3 N ; 2 ml ZnSO₄.7H₂O 5% ;  2 ml (NH₄)SO₄ 0,5 N ke dalam tabung centrifuge. Penambahan beberapa reagen ini boleh secara acak atau dicampurkan terlebih dahulu sebelum ditambahkaan ke dalam tabung sentrifuge karena ketiga reagen tersebut memiliki fungsi masing-masing. Penambahan Ba(OH)₂  berfungsi untuk memberikan suasana basa pada larutan darah. Karena adaya kondisi pH yang cukup ekstrem(basa) dapat mengakibatkan protein yang ada dalam darah mengalami proses denaturasi. Selain itu, penambahan (NH₄)SO₄ juga dapat membantu proses denaturasi dari protein. Karena sifat dari (NH₄)SO₄ yang sangat higroskopis, sehingga ia dapat mengikat air yang berada di dalam darah, sehingga protein-protein yang berada di dalam darah menjadi terdenaturasi. Penambahan ZnSO₄.7H₂O berfungsi untuk mempercepat reaksi denaturasi dari protein darah karena ia dapat memberikan jalan reaksi baru yang memiliki energy aktivasi lebih kecil dari energy aktivasi yag sebelumnya sehingga reaksi dapat berjalan lebih cepat. Selanjutnya, didiamkan selama 15 menit, tujuan dari didiamkan adalah agar proses pengendapan albumin bisa sempurna, barulah kemudian disentrifuse selama 15 menit pada kecepatan 3500 rpm. Tujuan disentrifuge ini adalah untuk memisahkan filtrat dan residu secara maksimal.

Setelah disentrifuge , darah terpisah menjadi dua fasa yaitu filtrate dan endapan. Filtrate yang didapat merupakan suatu larutan berwarna sedikit kekuningan dan endapan yang berwarna merah bata. Filtrate yang didapatkan tersebut merupakan filtrate  darah yang bebas protein yang dapat dipastikan dengan melakukan uji biuret. Hasil dari sentrifuge kemudian di dekantasi untuk memisahkan antara filtrate dengan endapan yang tebentuk. Filtrate yang di dapat kemudian diambil sebanyak 1 mL dan ditambahkan 3 tetes larutan biuret.  Penambahan biuret menyebabkan filtrate sedikit berubah warna menjadi sedikit keunguan. Padahal seharusnya, jika benar-benar filtat darah tersebut telah bebas protein maka akan menunjukkan warna filtart yang berwarna biru karena reagen biru tidak bereaksi dengan protein, sehingga dapat diketahui bahwa filtart draah tersebut masih mengandung sedikit protein yang nantinya akan menganggu proses pembacaan kadar di dalam spektrofotometer.

Pembuatan larutan untuk kurva  standart

Pada percobaan ini bertujuan untuk membuat kurva standar, sehingga akan diperoleh kurva yang memiliki persamaan regresi untuk digunakan sebagai penentuan kadar glukosa darah pada sampel darah. Disiapkan larutan standart glukosa dengan konsentrasi 0,1 mg/mL ; 0,3 mg/mL ; 0,5 mg/mL; 0,7 mg/mL; dan 0,9 mg/mL. larutan standart tersebut didapatkan dengan cara melakukan pengenceran bertingkat pada larutan standart glukosa yang memiliki konsentrasi 2 mg/mL. Kemudian, masing-masing larutan sstandart glukosa dipipet sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi.  Ditambahkan masing-masing 3 mL reagen Cu alkalis yang dapat dibuat dari larutan Nelson A dan Nelson B dengan perbandingan 4:1. Penambahan reagen Cu alkalis ini mengakibatkan larutan standart berubah warna menjadi biru muda. Kemudian dipanaskan diatas penangas air selama 15 menit. Proses pemanasan ini bertujuan untuk mempercepat reaksi redoks antara Cu alkalis dengan glukosa standart. Cu²⁺ yang berasal dari CuO akan berperan sebagai oksidator glukosa yang rantai tertutupnya putus sehingga menjadi rantai terbuka karena adanya proses pemanasan dan Cu²⁺  pun akan lebih mudah untuk mengoksidasi glukosa menjadi asam glukonat. Glukosa yang berperan sebagai reduktor, akan mereduksi Cu²⁺  dari CuO menjadi Cu₂O sehingga terbentulah endapan merah bata. Setelah proses pemanasan, larutan standart glukosa 0,1 mg/mL berubah warna menjadi biru sedikit kemerahan, larutan standart glukosa 0,3 mg/mL berubah warna menjadi biru sedikit kemerahan(+), larutan standart glukosa 0,5 mg/mL berubah warna menjadi biru kemerahan(++), larutan standart 0,7 mg/mL menjadi berwarna biru kemerahan(+++) dan larutan staandart glukosa 0,9 mg/mL berubah warna menjadi biru kemerahan(++++).

Setelah dipanaskan selama 15 menit, kelima larutan standart kemudian dimasukkan dalam air dingin selama 10 menit untuk menghentikan reaksi redoks antara glukosa dengan Cu alkalis, karena jika masih terjadi reaksi saat dimasukkan ke dalam spektrofotometer, maka hasil absorbansi yang didapatkan tidaklah valid karena nilainya sellau berubah-ubah. Selain itu, proses pendinginan juga berfungsi untuk mengoptimalkan kerja larutan arseno molibdat yang akan ditambahkan setelahnya.  Kemudian ditambahkan 3 tetes arseno molibdat yang sedikit berwarna kekuningan. Penambahan 3 tetes arsenomolibdat ini tidak mengubah tampilan fisik dari larutan standart, baik endapan yang terbentuk maupun warna larutan standart. Penambahan larutan arseno molibdat bertujuan untuk mengoksidasi kembali Cu⁺ menjadi Cu²⁺ .

Cu₂O (s) + arsenomolibdat (aq) ⟶ molybdenum (aq)

Larutan standart kemudian dilakukan uji dengan menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis  dengan panjang gelombang 660 nm untuk mengetahui nilai absorbansinya sehingga dapat dibentuk kurva standart yang nantinya digunakan sebagai pembanding absorbansi bagi larutan sampel darah agar dapat diketahui konsentrasinya. Spektrometer UV-Vis adalah sebuah instrumen untuk mengukur absorbsi/penyerapan cahaya dengan energi (panjang gelombang) tertentu oleh suatu atom/molekul. Dalam praktikum ini pengukuran dilakukan pada panjang gelombang pada  panjang  gelombang  660 nm. Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan Hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik melewati suatu media, maka sebagian cahaya tersebut diserap, sebagian dipantulkan, dan sebagian di pancarkan. Faktor yang mempengaruhi adalah konsentrasi dan bentuk wadah. Perubahan warna yang terjadi diamati dan intensitas warnanya diamati dengan  spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang maksimum yaitu 660 nm.Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang tersebut karena warna hijau(warna komplementernya biru)  memiliki rentang panjang gelombang pada 610-750 nm.

Pembuatan larutan blanko

Larutan blanko dibuat sebagai larutan standar pembanding, dimana dari larutan blanko ini dapat diperoleh nilai absorbansi yang  sebenarnya tanpa ada partikel-partikel lain didalam larutan tersebut. 1 mL aquades yang tidak berwarna dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 mL larutan Cu alkalis, larutan berubah warna menjadi berwarna. Kemudian larutan dimasukkan kedalam air mendidih selama 15 menit, dimana pemanasan ini bertujuan untuk mempercepat laju reaksi antara Cu alkalis dengan aquadest, lalu larutan didinginkan. Selanjutnya ditambahkan 1 mL pereaksi arsenomolibdat yang berwarna kekuningan. Selanjutnya larutan diukur absorbansinya dengan metode spektofotometri Uv-Vis pada  panjang  gelombang  660 nm. Panjang gelombang tersebut berada di rentang warna antara biru-hijau. Sehingga digunakan panjang gelombang 660 nm dikarenakan panjang gelombang maksimal untuk analat warna biru adalah 660 nm.

Pembuatan sampel uji glukosa darah

1 mL filrat darah bebas protein berwarna kekuningan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 3 mL larutan Cu alkalis berwarna biru muda. Kemudian dipanaskan diatas penangas air selama 15 menit. Proses pemanasan ini bertujuan untuk mempercepat reaksi redoks antara Cu alkalis dengan glukosa darah. Cu²⁺ yang berasal dari CuO akan berperan sebagai oksidator glukosa dalam darah yang rantai tertutupnya putus sehingga menjadi rantai terbuka karena adanya proses pemanasan dan Cu²⁺  pun akan lebih mudah untuk mengoksidasi glukosa menjadi asam glukonat. Glukosa yang berperan sebagai reduktor, akan mereduksi Cu²⁺  dari CuO menjadi Cu₂O sehingga terbentulah sedikit endapan merah bata.

Setelah proses pemanasan, laruatan tetap berwarna biru muda dan terbentuk gumpalan yang berwarna putih. Gumpalan ini merupakan sisa dari reagen yang digunakan dalam proses deproteinase darah (Ba(OH)₂ , ZnSO₄.7 H₂O dan (NH₄)₂SO₄ yang dapat bereaksi dengan Cu alkalis membentuk gumpalan berwarna putih.

Setelah dipanaskan selama 15 menit, larutan filtrat glukosa kemudian dimasukkan dalam air dingin selama 10 menit untuk menghentikan reaksi redoks antara glukosa dengan Cu alkalis, karena jika masih terjadi reaksi saat dimasukkan ke dalam spektrofotometer, maka hasil absorbansi yang didapatkan tidaklah valid karena nilainya sellau berubah-ubah. Selain itu, proses pendinginan juga berfungsi untuk mengoptimalkan kerja larutan arseno molibdat yang akan ditambahkan setelahnya.  Kemudian ditambahkan 3 tetes arseno molibdat yang sedikit berwarna kekuningan. Penambahan 3 tetes arsenomolibdat ini tidak mengubah tampilan fisik dari larutan glukosa daraht, baik gumpalan yang terbentuk maupun warna biru larutan. Penambahan larutan arseno molibdat bertujuan untuk mengoksidasi kembali Cu⁺ menjadi Cu²⁺ .

Cu₂O (s) + arsenomolibdat (aq) ⟶ molybdenum (aq)

Larutan standart kemudian dilakukan uji dengan menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis  dengan panjang gelombang 660 nm untuk mengetahui ansorbansinya yang nanti dapat ditentukan kadar glukosa dalam darah melalui pembanding kurva standart yang telah terbentuk.

Berdasarkan uji dengan menggunakan instrument spektrofotometer UV-Vis, didapatkan nilai absorbansi larutan standart yaitu :

-        Standar 1(0,1 mg/mL)  : 0.512

-        Standar 2 (0,3 mg/mL)  : 0.777

-        Standar 3 (0,5 mg/mL)   : 0.767

-        Standar 4 (0,7 mg/mL)   : 0.997

-        Standart 5(0,9 mg/mL)   ;0.956

        Sehingga didapatkan kurva standart :

Berdasarkan kurva di atas, diperoleh regresi (R²) sebesar 0,8312. Hal ini menunjukkan bahwa hasil yang diperoleh kurang akurat karena regresi yang dihasilkan jauh dari 0,9999 atau 1. Ini mendandakan bahwa standar yang digunakan kurang bagus sehingga menghasilkan absoransi yang naik turun. Hal ini dapat terjadi dikarenakan kuffet yang digunakan untuk uji dengan spektrofotometer UV-Vis terkontaminasi oleh sidik jari parktikkan sehingga menyababkan nilai absorbansi yng dihasilkan kurang valid karena sidik jari yang menempel pada kuffet juga ikut menyerap sinar yang dipancarkan. Kurva standart yang telah didapatkan, kemudian dijadikan sebagai pembanding untuk uji kadar glukosa dalam darah.

Dari hasil uji menggunakan instrument spektrofotometer UV-Vis , didapatkan nilai absorbansi sampel sebesar 1,123 dengan kadar glukosa sebesar 1,078 mg/mL atau 107,8 mg/100mL. hasil absorbansi yang didapatkan melebihi batas LOD dari instrument spektrofotometer UV-Vis yang berada dalam rentag absorbansi 0,1-1. Sehingga hasil yang didapatkan merupakan hasil yang kurang valid karena nilai absorbansinya melebihi batas LOD karena instrument menggunakan fungsi asumsinya. Hal ini dapat terjadi dikarenakan kuffet yang digunakan dalam proses uji, terkontaminasi oleh sidik jari praktikkan sehingga mengakibatkan absorbansi yang dihasilkan lebih besar dari yang seharusnya.

             X.            KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :

1.      Sampel darah masih berubah warna menjadi sedikit keunguan ketika diuji biuret menandakan sampel darah masih mengandung sedikit protein.

2.      Kadar glukosa yang diperoleh berdasarkan uji dengan spektrofotometer ialah sebesar 1,078 mg/L atau 107,8 mg/100 mL dengan absorbansi sebesar 1,123.

3.      y = 0.554x + 0.5248
R² = 0.8312

Sehingga didapatkan kadar glukosa darah secara teoritis:

          XI.            DAFTAR PUSTAKA

Achjadi K. 2003. Penyakit Gangguan Metabolisme. Bogor : IPB Press.

Aswani, V. 2010. How well do you understand blood glucose level? Available from: http://medscape.com/viewarticle/438114

Cranmer, H., dan Shannon, M. 2009. Blood Glucose Levels: Medical Reference from Healthwise. Hypoglycemia Diabetes Health Center.

Henriksen, EJ. 2009. Exercise effects of muscle insulin signaling and action invited review: effects of acute exercise and exercise training on insulin resistance. J Appl Physiolgy. Arizona: University of Arizona College of medicine. 93: 78-796.

Irawan, M.A., 2007. Glukosa dan Metabolisme Energi. Sport Science Brief. 1(6): 12-5.

Joyce, LeFever. (2013) Pedoman Pemeriksaan Laboratorium & Diagnostik Edisi 6. Jakarta : EGC.

Marks, B D; A. D. Marks; dan C. M. Smith. 1996. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis. Alih Bahasa Brahm U. Pandit. Jakarta : EGC Penerbit Buku kedokteran.

PERKENI. Konsesus Pengelolaan Diabetes Mellitus Tipe 2 di Indonesia. Jakarta: PERKENI; 2011.

Poedjiadji, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Penerbit UI-Press:Jakarta.

Tim Dosen. 2016. Petunjuk Praktikum Biokimia I. Surabaya : Jurusan Kimia Unesa.

Price, S.A., dan Wilson, L. M., 2005, Patofisiologi: Konsep Klinis Prosesproses Penyakit, Edisi 6, Vol. 2, diterjemahkan oleh Pendit, B. U., Hartanto, H., Wulansari, p., Mahanani, D. A.,Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

R.A.Day dan A.L.Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif edisi ke-6. Jakarta : Erlangga

       XII.            JAWABAN PERTANYAAN

Soal

1.  Tentukan kadar glukosa darah dalam mg glukosa/100 mL darah!

2.  Apa fungsi proses pendidihan pada percobaan diatas?

3.  Jelaskan peranan hormone insulin dalam proses pengaturan kadar glukosa!

Jawab:

1.      y = 0.554x + 0.5248
R² = 0.8312

Sehingga didapatkan kadar glukosa darah:

2.      Fungsi pendidihan dalam percobaan diatas yaitu untuk menambah laju reaksi. Selain itu juga berfungsi untuk melepas ikatan siklik dari glukosa sehingga gugus aldehid dari glukosa dapat mereduksi ion kupri (Cu²⁺) di dalam larutan kupritartrat menjadi ion kupro (Cu⁺) dalamsuasana basa.

3.    Peranan hormone insulin dalam proses pengaturan kadar glukosa:

a.         Menurunkan kadar glukosa plasma dengan cara meningkatkan ambilan glukosa oleh jaringan lemak

b.        Menghambat enzim  fosforilase

c.         Merangsang pengubahan glukosa ke glikogen untuk disimpan dalam hati

d.        Membantu glukosa dalam darah masuk ke sel untuk menghasilkan tenaga

e.         Merangsang oksidasi glukosa untuk tujuan respirasi dalam sel

Sehingga apabila kadar glukosa terlampau rendah, kurang dari jumlah normal, sel alfa pada kelenjar Langerhans akan mengsekresikan lebih banyak hormon glukagon, sehingga kadar glukosa dalam darah akan naik, proses ini akan berlanjut sehingga kadar glukosa dalam darah berada pada jumlah normal.

LAMPIRAN PERHITUNGAN PENGENCERAN

1.              Standart glukosa = 0,9 mg/mL =

2.              Standart glukosa = 0,7 mg/mL

3.              Standart glukosa = 0,5 mg/mL

4.              Standart glukosa = 0,3 mg/mL

5.              Standart glukosa = 0,1 mg/mL

LAMPIRAN GRAFIK

Konsentrasi	Absorbansi
0.1	0.512
0.3	0.777
0.5	0.767
0.7	0.997
0.9	0.956

LAMPIRAN FOTO

Bahan Bahan yang digunakan untuk Percobaan Penentuan Kadar Glukosa Darah	Larutan Nelson A dan B yang digunakan untuk Membuat Larutan Cu Alkalis
Persiapan larutan Ba(OH)2­, ZnSO4, dan (NH4)2SO4 untuk alur deproteinase filtrat darah	Larutan Nelson A dan B yang sudah dicampur untuk Membuat Larutan Arsenomolibdat
Larutan standar glukosa dan larutan blanko sebelum dipanaskan	Larutan standar glukosa dan larutan blanko sesudah dipanaskan dan ditetesi arsenomolibdat
2mL darah ditambahkan aquades, larutan Na-sitrat, Ba(OH)2­, ZnSO4, dan (NH4)2SO4	2mL darah ditambahkan aquades, larutan Na-sitrat, Ba(OH)2­, ZnSO4, dan (NH4)2SO4 Disentifuge dengan kecepatan 3500rpm selama 15 menit
Hasil 2mL darah ditambahkan aquades, larutan Na-sitrat, Ba(OH)2­, ZnSO4, dan (NH4)2SO4 disentifuge dengan kecepatan 3500rpm selama 15 menit	Filtrat darah hasil alur deproteinase filtrat darah ditetesi larutan biuret berwarna keunguan menandakan masih adanya protein dalam filtrat
Filtrat darah ditambahkan larutan Cu-alkalis	Filtrat darah ditambahkan larutan Cu-alkalis dipanaskan selama 15 menit
Filtrat darah ditambahkan larutan Cu-alkalis didinginkan selama 10 menit	Filtrat darah ditambahkan larutan Cu-alkalis Sebelum diukur absorbansinya dengan spektrofotometer